Hohe ALDH-aktivität Eine Neuartige … Funktionelle

Hohe ALDH-aktivität Eine Neuartige … Funktionelle

Hohe ALDH-aktivität Eine Neuartige ... Funktionelle

Hohe ALDH-aktivität: Eine Neuartige Funktionelle Marker von murinen Prostata Stamm- / Vorläuferzellen

abstrakt

Wir haben zuvor gezeigt, that Prostata- Stammzellen / Vorläuferzellen Können aus isolierten Prostata- Kanäle gereinigt Werden, basierend auf ihrer Expression des Hohen Sca-1-Oberflächenantigen. Wir berichten nun that ein hohes Maß ein Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH) aktivität vorhanden Sind in Einer Untergruppe von Prostata-Epithelzellen, Die Eine Anzahl von Antigenen auf Stamm- / Vorläuferzellen Anderer Herkunft (CD9, Bcl-2, CD200, CD24 gefunden Co -express, Prominin, 3/4 Oktober, ABCG2 und Nestin). Schnell alle this ALDH hallo Zellen Auch Sca-1 und ein drittel Davon exprimieren hohe Niveaustufen of this Antigen exprimieren. Die ALDH hallo Zellen HABEN Eine Größere in vitro proliferative Potential als Zellen mit Geringer ALDH-aktivität. Wichtig ist, Dass in Einem in vivo Prostata- Rekonstitution Assay Krieg sterben ALDH hallo exprimierenden Zellpopulation viel effektiver in Prostatagewebe als Eine Population von Zellen mit Geringer Enzymaktivität zu erzeugen. SOMIT Kann ein hohes Maß eine ALDH-aktivität Eine Funktionelle Markierung von Prostata-Stammzellen / Vorläuferzellen und ermöglicht Eine Einfache, Effiziente Isolierung von Zellen, mit primitiven Merkmalen berücksichtigt Werden sterben. Die Aufklärung der Rolle von ALDH in Prostata- Stammzellen / Vorläuferzellen can für treatment von Prostatakrebs und benigne Prostatahyperplasie zur Entwicklung rationeller Therapien Führen sterben.

Stichwort: Adulte Stammzellen, FACS, Vorläuferzellen, Sca-1

Introduction

Aldehyddehydrogenasen (ALDHs) Sind Eine Familie von enzymen, Aldehydfreies oxidieren sterben. Verschiedene ALDH Familienmitglieder spielen verschiedene Rollen in Entgiftungswege und Retinsäure-Biosynthese, Eulen Folsäure, Aminosäuren, Ethanol und Cyclophosphamid Stoffwechsel [1]. Stammzellen, sterben Aus einer vielzahl von Geweben exprimieren hohe Niveaustufen von ALDH-aktivität, und stirbt Kann ein merkmal sein, &# X0201c; stemness&# X0201d; [2. 3 ]. Hämatopoetische und neurale Stammzellen in Zellen, sterben ein hohes Maß eine ALDH-aktivität (ALDH hallo Zellen) angereichert Sind [4 &# X02013; 7] und ALDH hallo Zellen mit niedrigen Seitenstreuung Sind Selbst erneuernden und multi- [6. 8]. Das Fettgewebe gewonnene Stammzellpopulation Enthält Auch Eine Untergruppe von ALDH hallo Zellen [9] und der ALDH hallo Subpopulation von Knochenmarkzellen in hämatopoetischen, mesenchymalen und endothelialen Vorläuferzellen angereichert [10], war darauf hinweist, that Eine hohe ALDH-aktivität ein Allgemeiner sein Kann charakteristisch für Stamm- / Vorläuferzellen.

Normalen Stammzellen und Tumorzellen Haben viele Gemeinsame Merkmale [11], einschließlich Expression von Hohen Mengen eine ALDH der. Sowohl normale als Auch maligne menschliche Brust [12. 13] und Kolon [14] Stammzellen / Vorläuferzellen can basierend auf ALDH-1-aktivität Nachgewiesen Werden. Hoch ALDH-aktivität würde auch als ein Marker für Krebs Stamm- / Vorläuferzellen in Prostatakarzinom-Zelllinien eingesetzt [15]. Tumorzellen bowel cancer Xenotransplantate Initiieren Auch isoliert Wurde auf den Ebenen der ALDH-aktivität basiert [16] und Eine kleine Fraktion von Zellen aus Retinoblastom-Tumoren sterben Stammzellmarker ABCG2, ALDH1 und Sca-1 [17] exprimieren. So kann Expression von Hohen Mengen eine ALDH-aktivität sterben Sowohl tumorauslösende und Normalen Stammzellen zu identifizieren.

Wir haben gezeigt, that Prostatastammzellen im proximalen Bereich von Prostatagänge Konzentriert [18] und Kanns aus of this Region aufgrund ihrer Expression des Hohen Sca-1-Oberflächenantigen [19] aufgereinigt Werden. Wir zeigen nun, that Prostata-Stammzellen / Vorläuferzellen Auch ein hohes Maß eine ALDH-aktivität und that schnell alle this Zellen co-express Sca-1 exprimieren. Daruber Hinaus Haben sterben ALDH hallo Zellen Höherer in vitro und in vivo proliferative Potenzial als Zellen niedrige Niveaustufen of this Enzym exprimieren.

Materialen und Methoden

Tiere

C57BL / 6-Mäuse, athymischen Nacktmäusen und CDIGS Ratten gerechnet wurden in den Tierforschungseinrichtungen der Universität von Kapstadt oder New York University und alle Experimente gerechnet wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Review Board Exigences durchgeführt untergebracht.

Zellpräparation

Tiere (6 bis 8 Wochen alte C57BL / 6-Mausen) gerechnet wurden getötet und sterben Urogenitaltraktes Wurde en-Block in Hank Entfernt&# X02019; s balanced salt solution (HBSS), pH 7,4. Die dorsale, ventrale, laterale und anteriore prostates gerechnet wurden unter Einems Binokular 25-Gauge-Nadeln seziert. In Einigen Gefallene Wurde nur der proximale Bereich der prostatischen Kanäle (this Kanäle am Nächsten zu der Urethra) geerntet [18. 19]. Die Zellen gerechnet wurden Durch Inkubation Mit 0,5% Kollagenase Typ II (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in HBSS und 7,5% fötales Kälberserum (FCS) für 45 min bei 37 dissoziiert&# X000b0; C, gefolgt von Einems Verdau in 0,05% Trypsin für 8 min bei 37&# X000b0; C.

Die Trennung von ALDH hallo und ALDH lo Zellen

Zelle Verdaus gerechnet wurden MIT Lyse-Lösung behandelten roten Blutzellen zu lysieren (NH4 Cl 0,15 M KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM) verdünnt, mit HBSS plus 5% FCS, resuspendiert in Aldefluor&# X000ae; Puffer (Aldagen Inc. Durham, NC) und Durch ein 40 weitergegeben &# X003bc; m Nylon Zellsieb (BD Biosciences, Bedford, MA). Die Lebensfähigkeit der Zellen Wurde Durch Trypanblau-Ausschluss Bestimmt sterben und Zellen gerechnet wurden für 30 min bei 37 mit Aldefluor Substrat- inkubiert&# X000b0; C, mit und ohne den ALDH-Hemmstoff, Diethylaminobenzaldehyd (DEAB), nach Angaben des Herstellers&# X02019; s Anweisungen. Aldefluor Substrat-, Puffer und DEAB Wird als Bausatz von Aldagen Geliefert. Das Substrat- Wird Durch ALDH in ein grünes fluoreszierendes Produkt umgewandelt, das in der Zelle und detektiert in DEM FITC-Kanal zurückgehalten Wird. Nach der Inkubation gerechnet wurden sterben Zellen auf Eis und Gehalten Entweder in ALDH hallo und ALDH lo Populationen Durch Eine FACS Vantage SE Zellsortierers (Becton-Dickinson, San Jose, CA) für Getrennt in vitro und in vivo Wachstumsanalyse oder Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) -Analyse, inkubiert mit antikörper oder Isotyp-Immunglobuline für sterben Coexpression von ALDH-aktivität mit Verschiedenen other Antigenen (siehe unten) zu bestimmen.

Durchflusszytometrie

Zelle Verdaus gerechnet wurden in Aldefluor Puffer oder in FACS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), sterben Rinderserumalbumin (0,1%), Natriumazid (0,01%) und Aprotinin resuspendiert (20&# X003bc; g / ml)). Fc-Rezeptoren gerechnet wurden mit Maus-CD16 / 32-antikörper und Ratten-IgG blockiert und sterben Zellen gerechnet wurden mit antikörper inkubiert oder IgG Kontrolle für 30 min auf Eis und mit FACS-Puffer gewaschen. In Einigen Würde Experimenten der Farbstoff 7-Aminoactinomycin (7-AAD) (1 &# X003bc; g / ml) Wurde 5 min vor der Analyse zugegeben, so that tote Zellen ausgeschlossen Werden. Expression von intrazellulären Antigenen, Wie beispielsweise Bcl-2, ALDH1 / 2, ALDH3A1, ABCG2, Oct3 / 4, Nestin, CK5 und CK8 gerechnet wurden in Paraformaldehyd-fixierten Zellen Bestimmt, permeabilisiert mit 0,2% Tween 20 (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, Deutschland) in PBS. Zellen gerechnet wurden Auf einem FACSCalibur Durchflusszytometers (Becton-Dickinson, San Jose, CA) Analysiert, unter verwendung von Cellquest-Software (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Sca-1 + Zellen mit Fluoreszenzintensitäten Im oberen 1/3 gerechnet wurden als Sca-1 hallo Zellen Definiert.

Antikörper und Kontrolle Immunglobuline (IgG)

Ratten-Anti-Maus-CD9 Biotin (Klon KMC8) Wurde von BD Biosciences erhalten. Phycoerythrin (PE) konjugierten Ratte anti-Maus-Sca-1 (Klon D7), Ratten-Anti-Maus-Sca-1 Biotin (Klon D7), Ratten-anti-CD24-Biotin (Klon CT-HAS), Ratten-IgG2a Biotin, RatteIgG2b Biotin, Ratte IgM Biotin, Ratte IgG2a PE, Ratten-IgG, Maus anti-Maus-CD16 / 32 und Streptavidin konjugierte Allophycocyanin (SA-APC) gerechnet wurden von Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA Kaninchen anti-Nestin (Klon H85), Kaninchen-Anti-ABCG2 (Klon M-70), Kaninchen-Anti-Oct 3/4 (Klon H134), Kaninchen-anti-Bcl-2 (Klon N-19), Kaninchen-Anti-ALDH1 / 2 ( Klon H-85) und Kaninchen-Anti-ALDH3A1 (Klon M-76) gerechnet wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA, bezogen Ziege anti EpCAM Biotin und Ratte IgG2a Biotin (Klon 54447) gerechnet wurden von R&# X00026; D Systems Inc. Minneapolis, MN. Ratten-Anti-Biotin prominin1 (Klon 13A4) und Ratten-IgG1 Biotin (Klon eBRG1) stammten von eBioscience, Inc. San Diego, CA. Ratte anti-Maus-CD200 Biotin (Klon OX-90) Krieg von AbD Serotec, Oxford, UK. Kaninchen-anti-Maus-CK5 (Klon AF138) stammte von Covance, Berkeley, CA. und Maus-anti-Maus CK8 (Klon Ks8.7) Wurde von Fitzgerald Industries International Inc. Concord, MA. Mouse IgG1 und Kaninchen-anti-Maus-PE-Cy5 gerechnet wurden von Dako A / S erhalten, Glostrup, Dänemark, Ziege Anti-Kaninchen-APC von Southern Biotech, Birmingham, AL und SA AlexaFluor 488 von Molecular Probes, Inc. Eugene, St MO. Louis.

in vitro Wachstum von ALDH hallo und ALDH lo Zellen

ALDH hallo und ALDH lo Populationen gerechnet wurden aus dem Zellsortierer in Medium gesammelt (HBSS, 25 mM Hepes, 1 mM EDTA, 2% BSA) und für sterben Lebensfähigkeit bewertet unter verwendung von Trypanblau Ausgrenzung. Für jedes Experiment gerechnet wurden Zellen (1000&# X02013; 5.000 lebensfähigen Zellen / Vertiefung) gerechnet wurden dreifach oder vierfacher Ausfertigung in Kollagen beschichteten 96-Well-Platten ausgesät (PureCol: INAMED, Fremont, CA) in DMEM / F12 (1: 1) (Gibco: Invitrogen Ltd. Paisley, UK) enthaltend 10 % FCS, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) (10 ng / ml), Glutamin (2 mM), Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 &# X003bc; g / ml). Die Hälfte des Mediums Wurde Entfernt und Ersetzt alle 2&# X02013; 3 Tage und Zellzahl Würde nach ETWA 13 Tagen Bestimmt.

Die Implantation von Transplantaten unter sterben Nierenkapsel

FACS sortiert ALDH hallo und ALDH lo Zellen (4 &# X000d7; 10 4) mit Urogenitalsinus Mesenchym (UGM) Zellen Kombiniert gerechnet wurden (2,5 &# X000d7; 10 5) und resuspendiert in 30&# X003bc; l von Typ-1-Kollagen (BD Biosciences). Die Kollagentransplantate gerechnet wurden unter Nierenkapsel eingesetzt [20] sterben. Jedes Experiment enthielt Transplantat von UGM allein in that the Gewebewachstum, um sicherzustellen, führte nicht Urogenitalsinus Epithelzellen aus verunreinigen. Transplantat gerechnet wurden nach 10 Wochen geerntet und gewogen. UGM Würde aus dem Urogenitalsinus von 18 Tage alten Embryonen aus CDIGS Ratten isoliert [20 &# X02013; 22].

Immunhistochemie von Xenotransplantaten

Die Transplantat in Paraffin Eingebettet in 3% Paraformaldehyd und gerechnet wurden. Immunhistochemie Wurde Wie zuvor beschrieben durchgeführt [23]. Antikörper für Immunzytochemie gerechnet wurden used: (a) für Färbung von Basalzellen sterben: — Kaninchen-anti-Maus-CK5 (Klon AF138) (1: 200) von Covance, Berkeley, CA. gefolgt von Ziege-Anti-Kaninchen-AlexaFluor 594 (1: 2000). von Molecular Probes, Inc. Eugene, St. Louis, MO; (B) für Luminal Zellen: — Maus-anti-Maus CK8 (Klon Ks8.7) (unverwässert) von Fitzgerald Industries International Inc. Concord, MA. gefolgt von Ziege-anti-Maus-AlexaFluor 488 (1: 2000) von Molecular Probes; (C) für neuroendokrine Zellen: — Maus-Anti-Synaptophysin (Klon SY38) (1: 500) von Chemicon, Temecula, CA. gefolgt von Ziege-anti-Maus-AlexaFluor 488 (1: 2000) von Molecular Probes; (D) für Prostata-Sekret: — Kaninchen polyklonalen antikörper gegen dorsalen Prostatasekret (1: 2500), ein freundliches Geschenk von Dr. C. Abate-Shen (. Columbia University, New York, NY), Gefolgt von Ziege-Anti-Kaninchen HRP (1: 1000) von GE Healthcare UK Ltd. Little Chalfont, UK und Entdeckt Eine SK4100 DAB Erkennung Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA); (E) für Prostata-Spezifische Proteine: — Nxk3.1 (1: 600) Geschenk von Dr. C. Abate-Shen ein Krieg, gefolgt von ABC-Kit von Vector Laboratories. unter verwendung von nicht-Immunserum oder IgG anstelle von primären Antikörpern Die Spezifität der Färbung auf Wurde abschnitte ermittelt.

statistische Analyse

Die ergebnisse Sind als Mittelwerte und Standardabweichungen von Jedem Satz von Daten dargestellt. Vergleiche Zwischen den Gruppen gerechnet wurden aus den 2-tailed, gepaart mit Studenten&# X02019; s t Test oder das Whitney-U-Test-Mann. EIN p Wert von &# X0003c; 0,05 statistisch merkbar angesehen.

ergebnisse

Eine kleinere Population von murinen Prostata-Zellen exprimieren hohe Konzentrationen eine ALDH-aktivität

Als Stammzellen Anderer Herkunft zum Ausdruck bringen ein hohes Maß eine ALDH-aktivität [4 &# X02013; 10. 12] untersuchten wir sterben aktivität of this enzyms in Prostatazellen. Zellen aus Prostata- Verdaus gerechnet wurden mit Aldefluor Substrat- inkubiert in Gegenwart und Abwesenheit von dimethlyaminobenzaldehyde (of this Substrat- in ein grün fluoreszierendes Produkt Durch ALDH umgewandelt Wird) (DEAB: 10 &# X003bc; M), ein potenter Inhibitor von ALDH, um den Anteil ein Zellen zu bestimmen, sterben of this Enzym exprimieren. Wir fanden in that 8,1 &# X000b1; 2,1% der Zellen zeigen hohe ALDH-aktivität, mit ALDH hallo Bevölkerung Eine mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) 5,2-fach Höher (MFI = 348 aufweist sterben, &# X000b1; 96) (Abb. 1B, R1,) als sterben ALDH lo Bevölkerung (MFI = 67 &# X000b1; 34) (Fig. 1B, R2,) (S. &# X0003c; 0.001; n = 7) (Abb. 1 zeigt Eine von sieben Experimenten), sterben anzeigt that Eine Teilmenge von Prostatazellen hohe Niveaustufen von ALDH enzymatischer aktivität exprimieren. Die Mehrheit der ALDH hallo Zellen HABEN mittlere bis niedrige Seitenstreuungseigenschaften (Abb. 1B, R1), war darauf hinweist, that sterben Zellen mit Geringer bis mittlerer Körnigkeit oder Zelluläre Komplexität aufweisen. Phasenkontrastmikroskopie von DEAB Behandelt (Abb. 1C) oder FACS sortiert ALDH hallo (Abb. 1E) Zellen zeigen, Dass sie Torerfolg Bestehen aus kleinen Runden Zellen mit Einems ungefähren Durchmesser von 10 &# X003bc; Meter In ähnlicher Weise is also Keinen Unterschied in der Größe der ALDH hallo und ALDH lo Zellen (Supplementary Abb. S1). Unter Fluoreszenzmikroskopie mit DEAB zeigen behandelten Zellen keine Fluoreszenz (Abb. 1D), wohingegen in Abwesenheit des Inhibitors ALDH hallo sortierten Zellen zeigen helle grüne Fluoreszenz (Abb. 1F), das anzeigt, Dass sie ein hohes Maß eine ALDH-aktivität Enthalten.

Die Prostata Enthält Zellen mit Hoher ALDH-aktivität

Wie wir that Zellen mit Stammzelleigenschaften (quiescence, HÖHE proliferative Potential) im proximalen Bereich der prostatischen Kanäle Konzentriert Haben gezeigt [18], bestimmten wir sterben aktivität von ALDH in proximal-Zellen im Vergleich mit der Gesamten Prostata- isolierten Zellen. Wir fanden, Dass der proximale Bereich 2,2-fach mehr Zellen enthielten (S. &# X0003c; ein hohes Maß eine ALDH aktivität 0,01) exprimieren, als von der Gesamten Prostata- isolierten Zellen (proximale Region: 17.6 &# X000b1; 3,6%, n = 4; Ganze Prostata-: 8.1 &# X000b1; 2,1%, n = 7), war darauf hinweist, that ALDH hallo Zellen proximaler Konzentriert Sind (siehe Zusatz Abb. S2 für Eine repräsentative Darstellung). Wie wir jedoch mehr ALDH hallo Zellen von Digests der Gesamten Prostata erhalten, als nur von DM proximalen Bereich der Kanäle verwendeten wir Zellen von der Gesamten Prostata für phänotypische und Wachstumsassays, um sterben Gesamtausbeute eines ALDH hallo Zellen zu maximieren.

ALDH hallo Zellen Sind epithelialen Ursprungs und Expressantigene auf Stamm- / Vorläuferzellen Anderer Herkunft

Um Hallo- Zellen zu bestimmen, ob ALDH epithelialen Ursprungs Waren und enthielten Marker Durch Stammzellen Anderer Herkunft exprimiert, untersuchten wir this Zellen für Expression von EpCAM Marker von Epithelzellen sterben [24], als Auch für Antigene in Schaft Zellen. Wir fanden heraus, that schnell alle (98,1 &# X000b1; 1,5%, n = 3) ALDH hallo Zellen co-express EpCAM, sterben Epitheliale Natur of this Zellen wettet auf (Abb. 2B, C). In addition 70,2 &# X000b1; 10,0% (n = 5) von ALDH Hallo- Zellen exprimieren sterben basale Zell Cytokeratin, CK5 war anzeigt that sterben Meisten der ALDH hallo Zellen basal Ursprungs Sind [25], während 31,0 &# X000b1; 20,8% (n = 3) Drucken sterben Luminale Zellmarker, CK8 (Abb. 2C). This Daten zeigen, Dass 2,3-fach mehr Zellen mit Hoher ALDH-aktivität exprimieren CK5 als CK8 (p = 0,03).

ALDH hallo Zellen exprimieren Epitheliale Antigen-Eulen von Stammzellen / Vorläuferzellen exprimierten Antigene

Wir fanden, that 93,7 &# X000b1; 2,4% (n = 8) von ALDH hallo Zellen exprimiert Sca-1 (Fig. 2C, E). Sca-1 ist auf Prostata-Stammzellen [19. 26] Sowie Stammzellen Aus einer vielzahl von Geweben, Wie beispielsweise hämatopoetische, Herz-, Milchdrüse, Haut, Muskel und Testis [27]. Wichtig ist, that ETWA 40% (36,3 &# X000b1; 5,4%, n = 8) von ALDH hallo Zellen hohe Sca-1 (Sca-1 Hallo) (Fig. 2C, G) auszudrücken. Wir fanden Auch that 34,6 &# X000b1; 3,6% (n = 3) von Sca-1 hallo Zellen exprimieren hohe Konzentrationen ein ALDH-aktivität. Als Prostatazellen mit Hoher Sca-1 Haben Eine hohe in vivo Prostata- regenerieren Potential [19], stirbt zeigt, sterben Dass ALDH hallo bevölkerung erheblich in Stammzellen angereichert ist.

Analyse der Expression von ALDH1 / 2 (74,8 &# X000b1; 6,8%, n = 4) und ALDH3A1 (31,3 &# X000b1; 17,0%, n = 3) (Abb. 2C) wettet that sterben isolierten Zellen auf ein hohes Maß ein ALDH basierend Enzymatische aktivität exprimieren verschiedene Aldehyd-Dehydrogenase-Isoenzyms Proteine ​​(die ALDH1 / 2-antikörper Erkennt ALDH1A1, ALDH1A2 und ALDH1A3 Eulen ALDH2). ALDH3A1 und ALDH2 in Entgiftungsprozessen beteiligt Sind, ALDH1A1 aktiv Sowohl in der Entgiftung und der Retinsäure Weg, während ALDH1A2 und ALDH1A3 in der Retinsäure-Signalweg teilnehmen [1].

Die Mehrheit der ALDH hallo Zellen exprimieren Auch ein hohes Maß einer CD9 (97,5 &# X000b1; 2,1%, n = 3) (Fig. 2C), ein Protein, das eine embryonalen [28] und Stammsamenzellen [29], Eulen neuralen Vorläuferzellen [30]. Bcl-2, ein anti-apoptotische Protein [31], sterben von Prostata-, hämatopoetischen, Keratinozyten und Colon-Stammzellen [19 exprimiert Wird. 32 &# X02013; 35], ist in 82,7 &# X000b1; 5,8% (n = 4) von ALDH Hallo- Zellen (Fig. 2C). CD200, ein Haarfollikel exprimierte Antigen [36 DURCH. 37] und mesenchymalen Stammzellen [38] auf 70,5 gefunden &# X000b1; 5,7% des ALDH Hallo- Zellen (n = 4) (Fig. 2C). Schnelle Hälfte der ALDH hallo Zellen sterben exprimieren 3/4 Oktober (47,7 &# X000b1; 2,5%, n = 2), während 42,9 &# X000b1; 13,5% (n = 5) ausdrücken ABCG2, sterben Torerfolg in primitiven Zellen vorhanden Sind [39 &# X02013; 42]. Ungefähr drittel ein (37,3 &# X000b1; 10,4%, n = 3) von ALDH hallo Zellen koexprimiert CD24, Einems Antigen, auf Maus-Brust Stammzellen [43], während Prominin, Einems Protein, das auf hämatopoetische [44] und Neuronale Stammzellen [45] Sowie auf primitive Prostatazellen [ 46. 47] Wird ausgedrückt Durch 32,3 &# X000b1; 5,6% von ALDH Hallo- Zellen (n = 3) (Fig. 2C). Ein kleiner percentage der ALDH hallo Zellen (6.8 &# X000b1; 4,9%, n = 4) exprimieren Nestin, ein Protein, das eine Stammzellen von Prostata- und neuronalen Ursprungs [48. 49] (Fig. 2C).

Wir verglichen NEBEN der Expression der Verschiedenen auf ALDH Hallo- Zellen Mit den auf Zellen mit Geringer ALDH-aktivität (Tabelle 1) Antigene. Die Expression von ALDH1 / 2 Wurde 1,8-fach erhöht (p &# X0003c; 0,05) in der ALDH hallo Bevölkerung verglichen mit der ALDH lo Bevölkerung war zeigt that ALDH 1/2 Proteinspiegel korrelieren mit ALDH enzymatischer aktivität (Tabelle 1). CK5 Ausdruck Krieg erhöht Auch 1,8-fache (p &# X0003c; 0,05) in der ALDH hallo bevölkerung, sterben zeigen, that this Bevölkerung in basalen Zellen angereichert ist (Tabelle 1). Die Expression von Sca-1 Wurde 1,6-fach erhöht (p &# X0003c; 0,01), während sterben Fraktion von Zellen Hoher Sca-1 erhöht Wurde 1,8 fache MIT (p &# X0003c; 0,01) in den ALDH hallo Proben (Tabelle 1), war wettet that primitive Sca-1 Hallo- Zellen Werden mit Hohen ALDH-aktivität in der bevölkerung Konzentriert. Die ALDH hallo bevölkerung würde auch in Zellen sterben Bcl-2 (2,0-fach angereichert; p &# X0003c; 0,05), Oktober 3/4 (2,1-fach; p &# X0003c; 0,01), ABCG2 (2,5-fach; p &# X0003c; 0,05), CD24 (2,7-fach; p &# X0003c; 0,05) und CD200 (2,9-fach; p &# X0003c; 0.001) im Vergleich with the ALDH lo bevölkerung (Tabelle 1). Repräsentativen Dot-Plots der Expression von Oberflächenantigenen zusammen mit den Ebenen der Aldefluor in ALDH hallo gegen ALDH lo Zellen Eulen Isotypkontrollen Sind in Abb Ergänzungs dargestellt. S3. Für sterben FACS-Analyse der intrazellulären Antigene gerechnet wurden ALDH hallo und ALDH lo Populationen haben keinen Einfluss auf Durch FACS-Sortierung Getrennt sterben, anschließender Permeabilisierung der Zellen vor der Antigen-Visualisierung MIT (Supplementary Abb. S4). Dies Wurde als Permeabilisierung Gibt den Aldefluor Substrats von den Zellen durchgeführt. SOMIT ist es nicht Möglich, gleichzeitig ALDH-aktivität in verbindung mit intrazellulären Antigenen Durch FACS visualisieren.

Die Expression der angegebenen Antigene Durch ALDH Hallo- Zellen im Vergleich mit der Expression of this Antigene Durch ALDH lo Zellen

This Daten zeigen, that ALDH hallo Zellen in der Natur Epithel-, Überwiegend basale und Einer Anzahl von Oberflächen- und intrazelluläre Antigene exprimieren, sterben auf Stamm- / Vorläuferzellen Verschiedenen Ursprungs vorliegen. In addition exprimieren ETWA ein drittel der ALDH hallo Zellen hohe Sca-1, Einems Marker der Prostatastammzellen [19] und ETWA ein drittel der Sca-1 Hallo- Zellen exprimieren hohe Konzentrationen eine ALDH. Verglichen mit ALDH lo Zellen Wird sterben ALDH hallo bevölkerung in basalen Zellen angereichert, in Zellen, sterben hohe Niveaustufen von Sca-1, ALDH 1/2, Sowie Eine Anzahl von Antigenen Durch Stamm- / Vorläuferzellen exprimiert Werden, Wie Bcl-2, ABCG2 , CD200, Oktober 3/4 und CD24. Wichtig ist, that sterben ergebnisse zeigen Zum Ersten Mal that ALDH-aktivität ein funktioneller Marker für Prostata-Epithelzellen, sterben Auch mit Einems primitiven Phänotyp assoziierte Antigene exprimieren.

ALDH hallo Zellen HABEN Eine Größere Proliferationspotential in vitro als ALDH lo Zellen

Als ein Wichtiges merkmal von Stammzellen ihrer Hohen Proliferationspotential ist, verglichen wir das Wachstumspotenzial von ALDH hallo und ALDH lo Zellen. Prostata-Zellen gerechnet wurden Durch FACS-Sortierung isoliert basierend Expression auf der von Hohen oder niedrigen Niveaustufen von ALDH-aktivität (Abb. 1) und Derens Wachstum auf Kollagenfolien verglichen. ALDH Hallo- Zellen zeigten Höhere Wachstumspotential (3,3 fache; p = 0,012; n = 8) als ALDH lo Zellen (Abb 3 zeigt Eine solche einzelne Experiment.). Da jedoch sterben Differenz between DM in vitro Wachstum der Beiden ALDH-Populationen Auf eine Differenz between der geschwindigkeit der Proliferation zurückzuführen sein Könnte und nicht Auf einen Unterschied in der Wachstumspotential, verglichen wir sterben fähigkeit of this two Populationen Prostatagewebe zu regenerieren in vivo .

ALDH hallo Zellen HABEN Eine Bildende höhere in vitro proliferative Potential als ALDH lo Zellen

ALDH hallo Zellen Haben Eine Größere Prostata- Regenerationsfähigkeit als ALDH lo Zellen

Als sterben fähigkeit, Gewebe zu regenerieren in vivo Eine Eigenschaft von Stammzellen ist, stellten wir fest, sterben in vivo Hallo Wachstumspotenzial Zellen ALDH, verglichen MIT derjenigen von Zellen mit geringen Mengen of this enzyms. ALDH hallo und ALDH lo-Zellen gerechnet wurden FACS sortiert und this Populationen gerechnet wurden mit UGM Zellen (induktiv Mesenchyms für Prostatagewebe Kombiniert [20 &# X02013; 22]) und unter Nierenkapsel von Männlichen Tieren eingesetzt sterben. Jedes Experiment enthielt Auch Transplantat von UGM allein möglichkeit zu steuern sterben that sterben UGM Wurde nicht Vollständig von Urogenitalsinus Epithelzellen erschöpft. Die Menge des Prostatagewebes Erzeugt Wurde, nach 10 Wochen gemessen.

ALDH hallo Zellen Gebildet Deutlich mehr Prostatagewebe (29,8 &# X000b1; 11,0 mg: 2,5-fach) als ALDH lo-Zellen (12,0 &# X000b1; 1,8 mg p = 0,006) und 2,3-fach mehr als UGM-Zellen allein (12,9 &# X000b1; 3,1 mg; . P = 0,018) (4A, B) (n = 2: 6 Nieren für JEDE Population). Das Prostatagewebe von ALDH hallo Zellen erhalten Hatten normale Prostata Morphologie, umfassend basale und luminale Zellen Kanäle Enthält sekretorischen Produkte Futter sterben, während sterben spärliche Gewebe aus ALDH lo Zellen entstehen minimale sekretorischen-Material fehlt duktalen Strukturen had (Abb. 4C). UGM Zellen Gebildete Gewebe, sterben nur Stromaelemente Enthalten. Interessanterweise, während das Prostatagewebe abgeleitet von ALDH hallo Zellen Sowohl die basale enthielt (CK5 +) und Luminal (CK8 +) Zellen (Abb. 5A), sterben Durch ALDH lo Zellen Gebildeten Kanäle enthielt nur luminalen Zellen (Abb. 5B). Außerdem Waren Anwesend synaptophysin exprimierenden Zellen nur in Transplantat von ALDH entstehen hallo Zellen (Abb. 5C) und nicht diejenigen, aus ALDH lo Zellen Gebildet sterben (Abb. 5D), war darauf hinweist, that nur ALDH hallo Zellen anstieg ein Zellen neuroendokrinen Ursprungs GAB . Daruber Hinaus, obwohl das duktale Gewebe von ALDH hallo Zellen Gebildet reichlich sekretorischen PRODUKTEN Enthalten (Abb. 5E), wenig oder gar keine sekretorische Werkstoff Krieg in Kanalen von ALDH lo Transplantaten (Abb. 5F). Jedoch erzeugte Gewebe von ALDH hallo und ALDH lo Zellen zeigen Torerfolg sterben Expression von Nkx3.1, unter Angabe ihrer Prostata-Ursprung (Abb. 5 G und H). Die Daten zeigen, that sterben ALDH hallo bevölkerung möglichkeit sterben Funktionelle Prostatagewebe Enthält, basal, Luminal und neuroendokrinen Zellen während ALDH lo Zellen wenig Wachstum Haben zu regenerieren und Begrenzte Differenzierungspotential wurde darauf hinweist, that sterben Zellen Mit der Grössten Prostata- fähigkeit Innerhalb der Kammer befinden, zu regenerieren, sterben Enthält ein hohes Maß eine ALDH.

ALDH hallo Zellen Haben Eine Größere in vivo proliferative Potential als ALDH lo Zellen

ALDH hallo Zellen Sind in der Lage sekretorischen Prostatagewebe Enthält, basal, Luminal und neuroendokrinen Zellen zu regenerieren

Diskussion

Wir zeigen Zum Ersten Mal that Eine Untergruppe von Normalen Prostatazellen Maus zeigt ein hohes Maß eine ALDH-aktivität. Hämatopoetische, neuralen, mesenchymalen, Endothel- und Brust Stamm- / Vorläuferzellen in ALDH hallo Zellen angereichert [4. 5. 10. 12], und es wurde vorgeschlagen, that ALDH-aktivität Eine Funktionelle Markierung sein Kann, von &# X0201c; stemness&# X0201d; [2. 3 ]. Die ALDH hallo Zellen aus der Prostata exprimieren EpCAM, war darauf hinweist, that sie Epithelzellen [24]. Sie drucken Auch sterben Cytokeratin, CK5 und CK8, in basalen (CK5) und Luminal (CK8) Epithelzellen, in Einems Verhaltnis von 2,3 zu 1 betrug anzeigt, sterben Dass Mehrzahl der ALDH hallo Zellen basal Ursprungs Sind.

Eine erhebliche Anzahl von ALDH hallo Zellen co-express-Antigene, sterben auf Stamm- / Vorläuferzellen Anderer Herkunft vorhanden Sind, Wie CD9 [28 &# X02013; 30], Bcl-2 [19. 32 &# X02013; 35] und CD200 [36 &# X02013; 38]. Ein drittel bis Hälfte von ALDH hallo Zellen exprimieren CD24, Prominin Okt 3/4 und ABCG2, fänd Antigene auf Brust- sterben, hämatopoetische, neurale und Prostata-Stammzellen Eulen von primitiven Zellen Eine Seiten bevölkerung aufweisen [39 &# X02013; 47], während Eine kleine Teilmenge von ALDH hallo Zellen Nestin exprimieren, Auch ein Antigen von primitiven Zellen exprimiert [48. 49]. Verglichen mit der ALDH lo bevölkerung ALDH Sind hallo Zellen in Antigen-merkbar angereichert, sterben von Prostata- basalen Epithel exprimiert Werden, Wie CK5 und Bcl-2 und available in Antigenen mit Schutz- und entgiftende Funktionen beteiligt Sind, Wie beispielsweise Bcl-2, ABCG2 und ALDH1 / 2. Dies Kann dazu Dienen, Stamm- / Vorläuferzellen aus giftigen substanzen zu Schützen und ihre langfristige Überleben zu sichern. Die ALDH hallo Zellen Sind ebenfalls angereichert, im Vergleich zu ALDH lo Zellen, in Antigenen sterben in Stammzellen Anderer Herkunft, Wie CD200, Oct3 / 4 und CD24. Daruber Hinaus Enthält sterben ALDH hallo bevölkerung mehr Zellen sterben Sca-1, Eulen Zellen mit Einem Hohen Grad von Sca-1, sterben zuvor gezeigt that Eine Funktion von Prostata-Stammzellen [19], als bevölkerung mit niedrigem ALDH-aktivität exprimieren sterben . Weiterhin ALDH hallo Zellen im proximalen Bereich von Prostatagänge angereichert Sind, ein Bereich, in DM Stammzellen Konzentriert [18. 19. 50].

Interessanter wir nicht über Eine erhöhung der Expression von Prominin / CD133 in der ALDH hallo bevölkerung Gegenüber DEM ALDH lo bevölkerung FINDEN. Wir weisen Auch keine erhöhung der Prominin Ausdruck in der Stammzelle Enthält Sca-1 hallo bevölkerung Gegen die Sca-1 + bevölkerung und Prominin Ausdruck nicht in der Stammzell-angereichertem proximalen Bereich der Kanäle im Vergleich zu den übrigen bereichen der Kanäle (nicht veröffentlichte Beobachtungen Konzentriert ). Obwohl Prominin Würde als Marker für hämatopoetische, neuralen und Prostatastammzellen beschrieben [44 &# X02013; 47] Sowie Darmkrebs Initiieren Zellen [51. 52], Wurde vorgeschlagen, Dass seine Expression zu Stammzellen nicht Eingeschränkt ist [53. 54]. Normalen und malignen Menschlichen Kolon Haben Stammzellen Sowohl hohe ALDH-Protein-Expression und hohe ALDH-aktivität [14] und this Beiden Eigenschaften Sind spezifischer für Darmstammzellen als CD133 Expression auszudrücken recently gezeigt Worden sterben. Ein further Stammzellmarker sterben auf erwachsenen murinen Prostatastammzellen recently identifiziert Worden ist, ist c-kit (CD117) and a Ganze Prostata Kann Aus einer Zelle einzelnen wiederhergestellt Werden, das unter Anderem Oberflächenantigene, Auch c-kit exprimiert [46] sterben. Es wird interessant sein, das Auftreten von c-kit-Expression Durch ALDH hallo Zellen im Vergleich zu Zellen mit Geringer ALDH-aktivität zu bestimmen.

Wir zeigen, Dass Zellen Mit Hoher ALDH-aktivität Haben Größere In-vitro-proliferative Potential als Zellen geringe Mengen of this Enzym exprimieren. Wichtig ist, that ALDH hallo Zellen Eine Größere kapazität als ALDH lo Zellen Prostatagewebe in Einem in vivo-Transplantation Assay zu regenerieren. Prüfung der von ALDH hallo Zellen regenerierte Gewebe zeigt sterben anwesenheit von basal, luminalen und neuroendokrinen Zellen Eulen prostatische sekretorischen Material und-DM-Prostata Spezifisches Protein, Nxk3.1. This Daten Confirm that ALDH hallo Zellen Sind in der Lage in Mehrere Zelltypen zu differenzieren. Im gegensatz dazu zeigt geringe Menge ein Gewebe von ALDH lo Zellen abstammen Positivität für Nxk3.1 und auf sterben anwesenheit von luminalen Zellen EINEN Mangel ein Pluripotenz anzeigt sterben. This Beobachtungen Confirm that sterben Zellpopulation ein hohes Maß eine ALDH-Enzymaktivität exprimieren, Enthält Stamm- / Vorläuferzellen. ALDH-aktivität Kanns DAHER als neue Funktionelle Marker für Isolierung von primitiven Zellen der Prostata sterben used Werden.

Obwohl sterben Wechselwirkung between Substrat- und Aldefluor Verschiedenen ALDH-Isoformen gerechnet wurden nicht systematisch charakterisiert Worden ist, Wird das Substrat- Durch ALDH1A1 und ALDH3 Isoformen Erkannt, Aber nicht Durch mitochondriale Formular von ALDH (Aldefluor Kit-Informationen). Es ist nicht bekannt, dm gegenwärtig Isozym (n) (ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 und / oder ALDH3A1) für ALDH-aktivität von Stammzellen zeigten Verantwortlich ist und ob verschiedene Isozym Funktion in Verschiedenen ArTeN von Stammzellen / Vorläuferzellen (siehe [55] Überprüfung sterben ). ALDH Familienmitglieder spielen Rollen in Verschiedenen Stoffwechselprozessen and a Reihe von ALDH-Isoformen Sind in Retinsäure biosythesis beteiligt [1]. Retinoide in der Normalen Prostata Eine Wichtige Rolle spielen: Mangel ein Vitamin A der Ratte Embryonalentwicklung während hemmt reifen Prostata Entwicklung [56], Retinsäure initiiert Bildung Prostatahyperplasie Knospe [57], während der Frühen postnatalen Entwicklung Retinoide Notwendig Sind Verzweigung für Eine normale Prostata [58 ] und für reife Prostata Homöostase [59]. Umgekehrt Wird Angenommen that aberrante Retinsäuremetabolismus in der Entwicklung von Prostatakrebs beteiligt ist: levels von Retinsäure Sind 5&# X02013; 8 fach Niedriger in Prostatakarzinoms im Vergleich zu Normalen Prostata- oder benigne Prostatahyperplasie [60], Retinsäure-Rezeptor gamma (RAR&# X003b4;) Knockout-Mäuse Haben abnorme prostates [59], zellulärem Retinsäure-Bindungsprotein 2 (CRABP2) mRNA und Protein in Prostatakarzinomzellen im Vergleich zu normalem Gewebe [61] und Inaktivierung von RXR downregulated &# X0221d; Führt zu präneoplastischen Läsionen in der Prostata [62]. In addition Wird ALDH1A2 in normaler Prostata-Epithel exprimiert, Aber nicht in Prostatakrebs und ist ein Suppressor kandidaten Tumorgen in Prostatakrebs [63]. Weiterhin unterschiede in der Zellverteilung von RAR-Isoformen existieren between Normalen, gutartigen Prostata-Hyperplasie und Prostatakrebs Epithelzellen [64]. This Studien bedeutung der Rolle der Retinoid-Stoffwechsels in der Prostata Confirm sterben. Verschiedene Strategien zur Zeit Verfolgt Nützliche Mittel für treatment von Prostatakrebs zu identifizieren, umfassen ALDH-Inhibitoren [65] und den Retinsäuremetabolismus sterben blockierende Mittel [66].

Die Gegenwart von Hohen Niveaustufen von ALDH-aktivität in Einer vielzahl von Stammzellen Wirkt als Funktionelle Anstätt Eine phänotypische Marker für Stammzellen. Hess et al [7] vorgeschlagen, Dass, da sterben Zell-Phänotyp während des Zellzyklus ÄNDERN Können, sterben Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen auf der Basis Einer konservierten Stammzellfunktion Wie ALDH-aktivität, mit der on a Sich ändernden OBERFLÄCHE Phänotyp basiert bevorzugt sein Kann. Einige ALDH Isoformen wirken als Entgiftungsenzyme, sterben DAZU Dienen can, um Stammzellen aus toxischen Organische Verbindungen zu Schützen. Andere ALDH-Isozym, in Retinsäure-Biosynthese beteiligt ist, Kann Eine Rolle bei der Stammzellselbsterneuerung oder Differenzierung. Hemmung von ALDH Fördert Selbsterneuerung von sterben Menschlichen hämatopoetischen Stammzellen cellsthrough Hemmung von Retinsäure Signalisierungs [67] und Studien mit RAR &# X0221d; &# X02212; /&# X02212; und RAR &# X003b4; &# X02212; /&# X02212; Mäuse zeigen that RAR &# X003b4; von entscheidender bedeutung ist für Regulierung der HSC-Selbsterneuerung und Differenzierung [68] sterben. In der Haar Ausbuchtung (Stammzellnische) Wird ALDH1A2 Ganzen Anagen ausgedrückt und es wird vorgeschlagen, that Retinsäure in der Stammzell Wartung_BA in den Haarfollikel beteiligt ist [69]. Unsere Daten zeigen, sterben Dass murinen Prostata Eine Untergruppe von Zellen Enthält, sterben ein hohes Maß ein ALDH-aktivität exprimieren, und that this Zellen Prostata- Regenerierende aktivität Haben und viele Moleküle zuvor in Stammzellen Anderer Herkunft identifiziert exprimieren. ALDH-aktivität Kanns DAHER als neue Funktionelle Marker für Isolierung von Prostata-Stammzellen / Vorläuferzellen sterben used Werden. ist Notwendig Weitere Forschung, sterben Rolle of this funktionellen Marker in Diesen Zellen aufzuklären.

Zusammenfassung

Wir zeigen, Dass Eine Untergruppe von murinen epithelialen Prostatazellen hohe ALDH-aktivität aufweist, Eine Funktionelle Markierung von Stammzellen Anderer Herkunft. Die Mehrheit der ALDH hallo Zellen exprimieren mit Stammzellen / Vorläuferzellen-assoziierte Antigene, einschließlich Mehrerer, Die Eine Schütz Rolle, Wie beispielsweise Bcl-2 und ABCG2 Dienen. Die ALDH hallo bevölkerung Hut Eine Größere in vitro und in vivo proliferative kapazität als Zellen mit Niedriger ALDH-aktivität, war anzeigt, that this Bevölkerung Enthält Prostata-Stammzellen / Vorläuferzellen. Die Expression von Hohen ALDH-aktivität Durch Prostatazellen ist Eine neue Erkenntnis sterben mit der Isolierung und weiteren Charakterisierung von Prostata-Stammzellen und sterben Entwicklung von therapeutischen Strategien für treatment von gutartiger Prostata-Hyperplasie und Prostatakrebs unterstützen sterben.

Ergänzungsmaterial

Ergänzungs Abb. 1

Feige. S1. ALDH hallo und ALDH lo Zellen Sind von ähnlicher Größe:

Phasenkontrastbilder von ALDH hallo Zellen (EIN) und ALDH lo Zellen (B) zeigen, ZVE Zellpopulationen Verschiedenen ALDH-aktivitäten Haben wenig oder Keinen Unterschied in der Größe aufweist sterben. (Maßstabsbalken = 10 &# X003bc; m).

Ergänzungs Abb. 2

Feige. S2. Der proximale Bereich der Prostatakanäle in ALDH hallo Zellen angereichert:

Zelle Verdaue Von dem proximalen Bereich der prostatischen Kanäle (A, B) oder Die ganze Prostata (alle Regionen der Kanäle) (C, D) gerechnet wurden MIT Aldefluor in Gegenwart inkubiert (A, C) oder Abwesenheit (B, D) des Inhibitors, DEAB. Hohe Konzentrationen von ALDH-aktivität gerechnet wurden von 18,6% der proximalen Zellen exprimiert (B). Grund proximalen Prostatazellen Sind repräsentativ für vier Experimente. Zelle verdaut, aus der Gesamten Prostata-, sterben 8,9% ALDH hallo Zellen Enthalten (D). Grund Ganze Prostata Sind repräsentativ für 7 Experimente.

Ergänzungs Abb. 3

Feige. S3. FACS Analyse der Öberfläche von ALDH hallo und ALDH lo Zellen exprimierten Antigene:

Die Zellen gerechnet wurden mit Aldefluor Substrat- inkubiert (das Substrat- in ein grün fluoreszierendes Produkt von ALDH umgewandelt Wird sterben Durch FACS im FL1-Kanal gemessen Werden Kann) und anschließend inkubiert mit biotinyliertem antikörper gegen EpCAM, Sca-1, CD9, CD200, CD24 oder Prominin, gefolgt von SA-APC. Bedienelemente, geeignete biotinylierte antikörper used Werden, gerechnet wurden für jedes Antigen Enthalten. Die ALDH hallo und ALDH lo Populationen gerechnet wurden gated und für Antigen-Expression Analysiert. Dot-Plots zeigen den percentage von ALDH hallo oder ALDH lo-Zellen, sterben sterben angegebenen Antigene und schließen Ihre jeweiligen Isotypkontrollen auszudrücken. JEDE Parzelle ist ein Repräsentatives beispiel für Mehr als ein Experiment.

Ergänzungs Abb. 4

Feige. S4. FACS-Analyse von intrazellulären Antigene von ALDH hallo und ALDH lo-Zellen exprimiert:

Die Zellen gerechnet wurden mit Aldefluor Substrat- inkubiert und anschließend FACS sortiert in ALDH hallo und ALDH lo-Zellen. Die Zellen aus Jeder Bevölkerung gerechnet wurden mit polyklonalen Antikörpern Dann gegen CK5 permeabilisiert und inkubiert, ALDH1 / 2, ALDH3A1, Bcl-2, Oktober 3/4, ABCG2 oder Nestin, gefolgt von Ziege-Anti-Kaninchen-APC oder monoklonale antikörper gegen CK8, gefolgt von Kaninchen-anti-Maus-RPE-Cy5. Geeignete Isotypkontrolle antikörper gerechnet wurden für jedes Antigen Enthalten. Histogramm zeigen den percentage von ALDH hallo oder ALDH lo-Zellen, sterben angegebenen Antigene exprimieren sterben. JEDE Parzelle ist ein Repräsentatives beispiel für Mehr als ein Experiment.

Anerkennungen

Bestätigung der Zuschüsse: This Arbeit Wurde von der University of Cape Town Staff Research Fund Unterstützt, der südafrikanischen Medical Research Council, National Institutes of Health CA132641, NYS Department of Health, Amgen Inc. und der Helen L und Martin S Kimmel Center for Stem Cell Biology an der New york University School of Medicine.

Wir sind dankbar, Dass Ronnie Dreyer und Peter Lopez für Hilfe bei FACS-Sortierung sterben.

Fußnoten

Autor Beitrag: Patricia Burger: Konzeption und Design, Sammlung und Zusammenstellung von Daten, Datenanalyse und Interpretation, Manuskript schreiben, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

Rashmi Gupta: Sammlung und Zusammenstellung von Daten, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

Xiaozhong Xiong: Sammlung und Zusammenstellung von Daten, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

Christopher Ontiveros: Sammlung und Zusammenstellung von Daten, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

Sarah Salm: Sammlung und Zusammenstellung von Daten, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

David Moscatelli: Manuskript schreiben, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

E. Lynette Wilson: Konzeption und Design, Datenanalyse und Interpretation, Manuskript schreiben, sterben Endgültige genehmigung des Manuskripts.

Interessenkonflikt: Keiner

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